细胞培养的过程及注意事项

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细胞培养的过程及注意事项

　　细胞并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。下面是小编收集整理的细胞培养的过程及注意事项，希望对大家有所帮助。

　　细胞培养的过程及注意事项1

　　根据培养过程中是否需要分割培养物进行，再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。

　　一、原代培养

　　（一）过程

　　原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。

　　1、组织块培养法

　　(1)基本操作过程

　　1）用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

　　2）用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；

　　3）将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；

　　4）将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；

　　5）每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。

　　2、注意事项

　　1）组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

　　2）加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

　　3）用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

　　4）为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴物质的底壁附着。

　　2、分离细胞培养法—贴壁型细胞培养

　　（1）基本操作过程

　　1）首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。

　　2）低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。

　　3）根据培养的细胞类型和实验要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。

　　4）将培养瓶放入37℃恒温箱中培养。

　　5）每隔2到3天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。

　　（2）注意事项

　　1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的，而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，虽然营养物质很充足，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

　　2）原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

　　3）由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，由于细胞悬液中带有少量培养液，细胞即可以维持存活，又可以很快接触到培养瓶底壁，是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

　　3、分离细胞培养法—悬浮型细胞培养

　　（1）操作过程

　　1）制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。

　　2）在培养皿中加入足够的培养液。

　　3）将欲接种的细胞接种到培养器皿中。

　　4）在培养皿内放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送入恒温箱内。在磁力搅拌器上边搅拌边培养。若接种培养瓶或试管中，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒。有些细胞也可以不用磁棒或磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂包被的培养器皿内直接在培养箱中静置培养即可。

　　5）培养液略呈黄色换液。吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。

　　（2）注意事项

　　1）进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

　　2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

　　（二）原代培养的注意事项

　　1、在原代培养的1天到2天内，要特别注意观察是否有细菌、真菌的污染，一旦发现，要及时清除，防止造成其它细胞的交叉感染；

　　2、随着培养的进程，培养液中的营养物质被逐渐的消耗，营养成分越来越少，细胞代谢产物越来越多，有细胞呼吸过程中释放出来的CO2及其它产物如乳酸、丙酮酸等也逐渐增加。随着酸性物质的增加，培养液中的pH值越来越低，培养液的颜色也越来越黄。因此，在细胞培养的过程中，要注意培养液颜色的变化，并根据培养液的颜色来决定换液时间。正常情况下，培养液呈桃红色；当培养液呈橙黄色时，细胞一般生长情况良好；呈淡黄色时，可能培养时间较长，营养不足，死亡细胞较多；呈紫红色时，可能是细胞生长状态不好或已经死亡。所以，应在培养液略黄时吸出部分旧培养液，然后补加同等数量的'新鲜培养液。换液过程中，不要吸出细胞，不要使培养液溢出培养瓶，避免各种微生物的污染。换液时，应将培养液事先预温至37℃。

　　一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。2天到3天后，细胞恢复增殖活动。随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，消耗的营养物越来越多，需要换液的时间越来越短，当细胞逐渐长满培养瓶壁并形成一单层细胞时，细胞之间相互发生接触和联系，逐渐产生接触抑制作用，培养物生长速度减慢。当培养物最后形成一层完整的细胞单层时，生长几乎停止。在细胞高达80%融合时就需要进行传代了。

　　二、传代培养

　　(一)传代培养的过程

　　1、组织块培养物的传代过程

　　基本操作过程：

　　（1）将原代培养物连同底物盖玻片一同取出，置于无菌的培养皿上。

　　（2）用刀将培养物分割，刮去多余的部分，剩余继续培养的部分。一般是分割刮去组织块外围的部分组织，留下中央的部分组织继续培养。或部分分割并挑去组织块，留下迁移出来的细胞于底物盖玻片上继续培养。也可以将组织块挑出，再种植于新的底物盖玻片上继续培养。

　　（3）给剩余的培养物加上培养液，放入培养箱中继续培养。

　　2、分离细胞培养物—贴壁型细胞的传代过程：有两项核心工作：一是分割培养物，二是再接种。

　　基本操作过程：

　　（1）取出培养瓶，打开瓶盖，用吸管吸出旧的培养液。

　　（2）用无Ca、Mg的平衡盐溶液轻轻漂洗培养物1次到2次，洗去残余血清后弃去平衡盐溶液。

　　（3）在培养皿内加入胰蛋白酶溶液，室温下消化5min到15min显微镜下观察细胞突起缩回近似圆形、细胞之间的间隙增大时停止消化。

　　（4）吸管吸去消化液后立即加入含血清培养液或蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶的活性，使消化终止。

　　（5）用弯头吸管吸取培养皿内的培养液反复吹打瓶皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶皿底壁。

　　（6）低速离心，弃去上清液。

　　（7）用新鲜培养液将细胞沉淀重新悬浮，计数并调整细胞密度。

　　（8）根据传代目的将细胞悬浮液接种到一个或多个新的培养器皿中。

　　3、分离细胞培养物—悬浮型细胞的传代过程

　　基本操作过程：

　　（1）将培养物移入离心管低速离心。根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

　　（2）用吸管吸去上清液，加入新鲜培养液使细胞沉淀重新悬浮。

　　（3）根据传代目的将细胞悬液接种在一个或多个新的培养皿中。

　　（4）加足培养液，加盖封口，加入恒温箱中继续培养。

　　（二）传代培养的注意事项

　　1、离体培养的细胞生命力比较脆弱，因此传代时细胞没有生长到培养瓶底壁面积的80%以前，不要急于传代。

　　2、首次传代，由于原代培养中各种类型的细胞常混杂生长，传代时不同细胞又不同的消化时间，因而要根据需要注意及时处理。

　　3、对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。吹打时动作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。

　　4、对于贴壁能力较弱，容易脱壁的细胞，可以不经蛋白酶原消化处理和终止消化这两步，直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。这种直接吹大的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。高强度机械吹打易对细胞造成伤害较大，细胞也常有较大数量的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后才能吹打，一般不单独采用高强度机械吹打。

　　5、首次传代时适当增大接种的细胞密度，使培养的细胞间尽快发生相互作用，有利于传代细胞的存活。

　　6、传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。

　　7、传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢罢了。

　　8、每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传特性往往容易发生改变。经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞。因此，传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。

　　三、细胞培养的注意事项

　　每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?

　　早走早脱身，从此专注黑生物。

　　1.严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。

　　2.不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。

　　3.有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。

　　4.水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。

　　5.晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。

　　6.最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。

　　四、非科班出身经验分享

　　1.别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。

　　2.动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来...刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。

　　3.离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。

　　4.实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30分钟。

　　5.身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。

　　6.细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。

　　大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰;该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。

　　最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了5天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。

　　换种心情，好好生活!

　　五、养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：

　　1.培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。

　　2.不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说MDAMB231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。

　　3.对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。

　　4.冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。

　　5.培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。

　　6.养细胞最大的教训：不能偷懒!

　　细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。

　　1.不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染;迅速扩增冻存。

　　2.发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时;细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的kit定期检测一下。

　　3.细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。

　　4.细胞的传代一定要规律，保持相同的confluency和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。

　　5.注意个人卫生。

　　靠内心感动细胞

　　1.自己的细胞自己养，血的教训。

　　2.在生物安全柜(或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施(比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA等等)且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。

　　3.上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊(不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。

　　4.少对细胞说话，多靠内心来感动它们(是的!心不诚是不可以的!)至少1天看1次。

　　养细胞很容易

　　养细胞真的不难，最关键几点：

　　1.所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。

　　2.动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。

　　3.有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。

　　4.要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。

　　5.个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。

　　6.细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。

　　细胞养不好，自挂东南枝

　　现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：

　　1.好的洁净室，空调系统跟得上。

　　2.好的生物安全柜，硬件跟的上。

　　3.瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。

　　4.任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。

　　5.虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。

　　6.实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。

　　养细胞就像打仗

　　细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞...甚至各类干细胞...每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:

　　1.各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭...教训惨痛。

　　2.培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。

　　3.尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。

　　4.把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。

　　5.经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。

　　养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。

　　细胞就是矫情

　　养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性!但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三，所以说，有的细胞就是矫情。

　　细胞培养的过程及注意事项2

　　细胞培养技术的发现，使得很多研究不必局限于在动物或人体内进行，试验环境更为简单，目的更为明确，如：细胞内活动的基础研究；细胞与细胞相互作用；细胞与环境间的相互作用；遗传学与细胞转化；细胞产物和分泌等等。

　　细胞培养技术的发展很大程度上是由医学研究的需求而促进的，如：抗病毒疫苗的研究，肿瘤发生及治疗的研究；基因重组技术；单克隆抗体技术；组织工程；染色体分析等体外检测技术，以及体外辅助生殖技术。

　　科研实验中，细胞的体外培养一直是一个重要环节。细胞要养好，就要用好血清，如Ausbian特级胎牛血清，它适合各种细胞培养，尤其适合难养细胞，如：干细胞、肝细胞，神经细胞，原代培养、细胞融合、转染细胞等。

　　细胞培养的具体步骤

　　一、细胞复苏

　　将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

　　加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液。加入10mlDMEM培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的'细胞培养箱中培养。

　　二、细胞传代

　　细胞密度达到80%~90%时.去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1mlDMEM培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

　　加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10mlPBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

　　三、细胞冻存

　　细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

　　加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

　　冻存液的配制：70%的培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

　　注意事项

　　（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

　　①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

　　②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

　　③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

　　④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

　　⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

　　⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

　　⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

　　（2）细胞污染的预防

　　①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

　　②操作过程防止污染。

　　③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

　　④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

　　⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

　　⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。

　　⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。

　　⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。

　　⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。

　　⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

　　（3）防止细胞交叉污染

　　①在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生t昆乱。

　　②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。

　　③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。

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